Зростає стурбованість з приводу поширення трансгенної ДНК шляхом горизонтального перенесення генів. Одним з головних факторів, що визначають успішність горизонтального перенесення генів, є тенденція до рекомбінації. У цій статті аналізуються аспекти безпеки недавніх відкриттів, які стосуються “гарячої точки” рекомбінації промотора вірусу мозаїки цвітної капусти (ВМЦК), який наявний практично у всіх наразі існуючих трансгенних культурах, що вирощуються комерційно, або проходять стадію польових досліджень.
У якості запобіжного заходу, ми наполегливо рекомендуємо негайно припинити комерційне вирощування та дослідження у відкритих польових умовах усіх трансгенних культур, що містять 35S промотор ВМЦК чи подібні промотори, які здатні до рекомбінації. Усі продукти, отримані з таких культур, які містять трансгенну ДНК, також негайно повинні бути прибраними з продажу та вжитку людей, а також не використовуватися для годування тварин.
Поява у природному середовищі трансгенних культур викликає стурбованість з приводу поширення трансгенної ДНК, не тільки шляхом перехресного запилення зі спорідненими видами, але, перш за все, шляхом горизонтального перенесення генів до неспоріднених видів. Зважаючи на присутність ДНК у всіх середовищах та на здатність практично усіх клітин підбирати “голу” або вільну ДНК, успішність горизонтального перенесення генів може залежати, значною мірою, від природи самої ДНК. Нові відкриття, котрі стосуються “гарячої точки” рекомбінації ВМЦК, спонукали нас звернути увагу на аспекти безпеки, пов’язані з використанням промотору цього вірусу. Це завдання є нагальним, оскільки промотор ВМЦК присутній практично у всіх трансгенних культурах, які вже вирощуються комерційно чи проходять стадію польових досліджень.
Вірус мозаїки цвітної капусти є параретровірусом хрестоцвітих рослин. Його геном має вигляд дволанцюгової циркулярної ДНК, з трьома одноланцюговими ділянками та ємністю 8 тисяч пар основ. Два великі транскрипти РНК (19S та 35S) і шість великих відкритих рамок зчитування кодуються ДНК. Транскрипція відбувається у ядрі рослинної клітини, а вірусна ДНК синтезується в цитоплазмі шляхом зворотної транскрипції 35S РНК-транскрипту. Філогенетично, ВМЦК належить до групи каулімовірусів, котрі найбільше споріднені з гепаднавірусами тварин, до яких належить людський вірус гепатиту В. Зворотна транскриптаза ВМЦК, проте, найбільш подібна до ретротранспозонів, які належать до групи Gypsy, а також до ретровірусів. Це дозволяє зробити припущення, що ВМЦК, в процесі еволюції, виник внаслідок горизонтального перенесення ретротранспозону до рослини з родини хрестоцвітих, або ж в результаті захоплення гену зворотної транскриптази вже існуючим на той момент вірусом чи здатним до транспозиції елементом, який потребував додаткових генів для того, щоб стати вірусом.
Промотор ВМЦК – це послідовність з приблизно 350 основ, що входять до складу 35S транскрипту (-343 до +8), з них близько 250 основ перекриваються з 3′-кінцем гену Vl, останньої з шести великих відкритих рамок зчитування. У промоторі є три домени, серцевинний промотор містить ТАТА-бокс (-46 до +8),, а два інші великі домени виконують функції посилення. Регіон А (-90 до -46), головним чином, потрібен для експресії у коренях, а регіон В (-343 до -90) для експресії у листі. Субдомени регіону В (від В1 до В5) можуть бути розпізнаними спираючись на різні взаємодії з різними факторами транскрипції. Однак, увесь регіон В дозволяє повнішу конституційну експресію, ніж очікувана від комбінації субдоменів. Це дозволяє припустити, що важливі елементи є в інтерфейсах субдоменів, або ж комбінація субдоменів має не просто аддитивний ефект, а спричинює якісно нові властивості.
Роль різних субдоменів 35S промотора в патогенезі ВМЦК почала вивчатися відносно недавно. Ці дослідження показують, що втрата до 40 амінокислот з 3′-кінця гену Vl (який перекривається з 35S промотором) не відображалася на патогенезі, тоді як подальше скорочення у гіпотетичній ділянці “цинкового пальця” було фатальним для вірусу. Видалення ТАТА-боксу також усувало інфекційність. Однак, делеції в регіоні енхансера між -207 та -56 толерувалися навіть тоді, коли повне видалення цього фрагменту спричинювало втрату інфекційності. Два окремих енхансерних домени, що впливають на інфекційність, були ідентифіковані, -207 до -150 та -95 до -56, але лише один із них є необхідним. Енхансерний регіон міг працювати навіть будучи розміщеним у зворотному напрямку. Сторонні генні послідовності могли бути уведені в мутантів, що зазнали делеції, – це може змінювати інфекційні властивості вірусу.
Різні гібридні чи комбінаційні промотори були сконструйовані на основі 35S промотору ВМЦК, що призводить до вдосконаленої експресії трансгенів: подвоєні промотори 35S, гібрид, який містить серцевинний промотор 19S від ВМЦК та розташовані вище енхансери 35S, та комбінація 35S ВМЦК з елементами маннопінсинтази, або з Adh1- та ocs–промоторними елементами для експресії в однодольних. Ці результати підкреслюють модульність та взаємозамінність промоторних елементів, що має важливі наслідки для безпечності трансгенних рослин. Це означає, що, у дійсності, рекомбінація промоторних елементів ВМЦК зі сплячими, ендогенними вірусами може створити нові інфекційні віруси у всіх видах, до складу яких уведена трансгенна ДНК.
Іншим фактором, який впливає на безпечність трансгенних рослин, які містять промотори ВМЦК та споріднені конструкти, є та обставина, що хоча вірус мозаїки цвітної капусти, як такий, уражує лише дводольних, його промотор є нерозбірливим у цьому відношенні й ефективно функціонує в однодольних, клітинних лініях хвойних, зелених водоростях, дріжджах та E. coli . Перенесення промотора ВМЦК до цих видів могло б також спричинити непередбачувані ефекти експресії генів, які могли б вплинути на екосистему в цілому.
Протягом певного часу відомо, що може відбуватися рекомбінація між різними штамами ВМЦК в рослинах, між різними гомологічними частинами інтегрованих вірусних послідовностей ВМЦК в трансгенних рослинах та між інтегрованими трансгенами та інфікуючими вірусами. Аналіз рекомбінаційних з’єднань робить припущення, що одна з “гарячих точок” рекомбінації була на 3′-кінці 35S промотора, вважалося, що вона пов’язана, у першу чергу, з перемиканням шаблонів під час зворотної транскрипції. Такий тип рекомбінації залежить від гомології послідовностей між партнерами, які рекомбінують, а також від дії кодованої вірусом зворотної транскриптази, очікується малий вплив на негомологічну ДНК, яка належить іншим організмам. Однак, була підозра, що рекомбінація може також відбуватися між дволанцюговими ДНК, оскільки рекомбінаційні з’єднання були виявлені далеко від місця ініціації синтезу ДНК (де розташований 35S промотор).
Репарація дволанцюгової ДНК, як визнано, причетна до нелегітимної рекомбінації, яка уможливлює інтеграцію плазмідної ДНК в геноми рослин з наступною трансформацією рослин; а трансгенні перестановки були ідентифіковані як у опосередкованих Agrobacterium трансформаціях, так і при “бомбардуванні часточок”. Нелегітимна рекомбінація також спостерігалася між резидентним трансгеном у трансгенній рослині тютюну та щойно доставленим трансгеном. Нелегітимна рекомбінація проходить між послідовностями с мікрогомологією, чи взагалі без гомології, між з’єднаннями, часто спричиняючи наповнення ДНК та делеції нуклеотидів з одного чи обох рекомбінуючих кінців.
Кохлі та колеги проаналізували 12 сукупностей ліній трансгенного рису, трансформованих інтеграцією плазмід шляхом “бомбардування часточок” для дослідження долі екзогенної трансформуючої ДНК. Вони не тільки виявили такий само тип нелегітимної рекомбінації між плазмідами, але також багато нелегітимних рекомбінацій, що проходили у “гарячій точці” промотору 35S ВМЦК, які були попередньо ідентифіковані. Понад те, рекомбінація відбувалася з високою частотою без участі кодованої вірусом зворотної транскриптази чи інших ферментів, що дозволяє припускати, що фактори рослин можуть спрямовувати рекомбінаційні події шляхом впізнавання та використовування вірусних послідовностей, які мають високу схильність до рекомбінації.
“Гаряча точка”, визначена Кохлі та колегами, містилася в недосконалому паліндромі 19 bp біля 3′-кінця 35S промотора ВМЦК, що містить ТАТА-бокс. Паліндром та прилягаючі послідовності ДНК, як виявилося, мають низку характеристик, спільних з відомими “гарячими точками” рекомбінації. Одна половина 19 bp паліндрому була багатою на пурин, – відомо, що протеїни-рекомбінази зв’язуються з такими регіонами. Місця розщеплення топоізомеразою I, тринуклеотиди AAG, також виявлені у вигляді кластерів біля рекомбінаційних з’єднань у “гарячій точці”, яка була частиною з’єднання або була представлена у межах його 3 bp у 8 з 11 з’єднань, проаналізованих Кохлі та колегами. Регіон 32 bp, зі вмістом 90% АТ, був знайдений у 28 bp промотору 35S із паліндрому. Багаті АТ регіони зумовлюють ізотропне зв’язування ДНК та впливають на плавлення ДНК. Вони містять мотиви матриксного прикріплення, які підтримують нерозривно вигнуту ДНК, вони були виявлені поблизу інших “гарячих точок” рекомбінації. Сам паліндром 19 bp містить короткий тракт пурин-піримідинових послідовностей, які чергуються, в трансгені. Такі залишки відомі у якості факторів підтримання Z-конформації ДНК, було показано, що вони впливають на транскрипцію та рекомбінацію, а також є сайтами зв’язування топоізомерази II, яка специфічно задіяна у дозволі рекомбінації інтермедіатів.
Структура та специфічні властивості послідовностей 3′-кінця промотора 35S ВМЦК є подібними до посилюючих трансформацію послідовностей петунії, які ефективно посилюють трансформацію рослини, найімовірніше, шляхом стимулювання рекомбінації. Подібні структури та специфічні характеристики послідовностей були ідентифіковані для здатних до рекомбінації регіонів ДНК SV40 у клітинах Hela. Межові повтори 25bp Agrobacterium T-ДНК, найбільш поширений у використанні вектор для трансформації рослин, також показують примітну подібність до “гарячої точки” рекомбінації промотора 35S ВМЦК. Там є 11 bp недосконала паліндромна послідовність зі структурою, подібною до ТАТА-бокса на правій межі, тоді як ліва межа має коротку збагачену пурином послідовність у центрі. Кохлі та колеги прогнозують, що ці два регіони Т-ДНК можуть бути причетними до перестановок, які часто спостерігаються при трансформаціях рослин, котрі проходять при посередництві Т-ДНК.
Зрозуміло, що 35S промотор ВМЦК добре забезпечений мотивами, які задіяні в рекомбінації. Додатковий фактор, який може збільшувати нестабільність плазмід – це з’єднання між промотором 35S ВМЦК та сторонньою ДНК. Усі ці аспекти роблять досить вірогідним те, що промотор 35S ВМЦК буде брати участь у горизонтальному перенесенні генів та рекомбінації, а також зумовлювати масштабні геномні перестановки в процесі.
Горизонтальне перенесення промотора ВМЦК не тільки робить свій внесок у відому нестабільність трансгенних ліній, але також має потенціал для реактивації сплячих вірусів чи створення нових вірусів в усіх видах, до яких він переноситься, зокрема, зважаючи на модульність та взаємозамінність елементів промотора. З цієї точки зору, тісний зв’язок між ВМЦК та гепаднавірусами, на кшталт людського вірусу гепатиту В, має привертати особливу увагу. Окрім іншого, й через те, що промотор ВМЦК є нерозбірливим у функціонуванні (див. вище), він має здатність просувати невластиву потужну експресію генів в усіх видах, до яких потрапляє. Одним із наслідків такої невластивої потужної експресії генів може бути рак.
Наші міркування слід брати до уваги у світлі результатів першого систематичного тестування безпечності трансгенної їжі, яке супроводжувалося гістологічними дослідженнями, котрі були здійснені Пусцаї та його колегами. Евен та Пусцаї дійшли висновку, що значна частина токсичних ефектів трансгенної картоплі з конвалієвим лектином була зумовлена “конструктом чи генетичною трансформацією (або і тим, і тим)”. Вони далі стверджують: “Можливість того, щоб рослинний вектор широкого вжитку у деяких генетично модифікованих рослинах міг зумовлювати мукоз гастроентерального тракту та спричиняв потужні біологічні ефекти та таку ж можливість стосовно генетично модифікованих рослин, які містять подібні конструкти…” При модифікації рослин, вектором широкого вжитку є Т-ДНК Agrobacterium, а конструктом, стосовно якого виникають ці питання, – 35S промотор ВМЦК, обидва ці компоненти містяться в трансгенній картоплі, яку тестували Евен та Пусцаї.
У якості запобіжного заходу, ми наполегливо рекомендуємо негайно припинити комерційне вирощування та дослідження у відкритих польових умовах усіх трансгенних культур, що містять 35S промотор ВМЦК чи подібні промотори, які здатні до рекомбінації. Усі продукти, отримані з таких культур, які містять трансгенну ДНК, також негайно повинні бути прибраними з продажу та вжитку людей, а також не використовуватися для годування тварин.
Мае-Ван Хо, Ангела Райан
Джерело: I-SIS.ORG.UK
Переклад з англійської: Юрій Косенко
P.S. Ознайомитися з посиланнями та літературними даними, використаними авторами статті, можна перейшовши на сайт першоджерела.
